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MSI位点选择的发展历程

人阅读 发布时间:2021-04-20 10:43

        微卫星不稳定(MSI)是非常重要的泛癌种标志物,对肿瘤的诊断和治疗有深远的临床价值。据报道人类基因组中有1900万个微卫星位点,而错配修复系统缺陷并不会导致所有的微卫星位点不稳定,近年国内外对MSI位点的选择也有了很多进展,到底应该检测哪些位点呢?
MSI位点选择的发展历程
        早在1997年,在美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)提出了5个微卫星的评价系统,包括:BAT-25,BAT-26,D5S346,D2S123,D17S250(2B3D),其中D5S346,D2S123,D17S250为双核苷酸微卫星。
        2002年,Suraweera等的研究发现双核苷酸位点在MSI-H的检出率只能到60%~80%,而且双核苷酸位点本身更趋于不稳定,对结果图谱判读的难度增大,容易得到错误的分类结果。他们研究出的pentaplex体系,含有5个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24),检测灵敏性均在95%以上。在该团队后续的研究中,NR-22由于扩增兼容性问题被NR-27替代。
        2004年Bethesda指南中指出了pentaplex体系的高灵敏性和特异性,同时指南中还提出可以选择一些多核苷酸位点作为内对照防止样品间的混淆。
        2006年,国外某厂家(以下简称“A公司”)的7位点MSI检测体系出现,包括5个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,MONO-27,NR-21,NR-24)和2个对照位点(PentaC,PentaD)。该体系中使用MONO-27替代了NR-22。
 
        结合文献研究和行业研究,汇总MSI检测的影响因素如下:
        ■ 微卫星类型:单核苷酸的微卫星具有更高的灵敏性,有研究表明随着微卫星核苷酸数量的增加,灵敏性呈逐渐下降的趋势;
        ■ 微卫星位点数量:并不是数量越多越好,增加微卫星可能会降低检测的灵敏性;
        ■ 微卫星在肿瘤中的不稳定检出率:阳性率越高的微卫星趋于有更高的灵敏性;
        ■ 微卫星位点的多态性:更倾向于单态的微卫星,可以降低结果判读的复杂性,增加判读的准确性;
        ■ 检测体系的兼容性:待检测的微卫星是否可以做到单管扩增,以实现操作简便、减少误差的目的。
鉴于单核酸位点高敏感度和特异性,中外指南也做出推荐
        鉴于单核苷酸重复序列panel较高的敏感性和特异性,2019年8月,ESMO发布癌症免疫治疗专家共识,推荐使用单核苷酸重复序列panel进行MSI检测。
        2020年第3期胃癌NCCN指南:MSI检测推荐单核苷酸位点panel。
        2019年结直肠癌及实体瘤MSI检测专家共识指出:基于PCR法中的pentaplex panel的5~7个标志位点组合BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR27、MONO27和NR22被认定为PCR–MSI检测的金标准。
 
 
        整合国内外研究数据及指南进展我们最终选择了一个6种单核苷酸重复的组合Microread MSI Panel。如下图:
 
 
为什么单核苷酸重复位点具有更高的灵敏度和特异性呢?
A:单核苷酸重复位点更倾向单态
        阅微基因前期在327个中国人群中的研究发现,以下6个位点的杂合度在1%~10%之间。
 
 
B:选择的Microread MSI Panel与基因转录调控功能相关
        同时,这些位点所在的基因参与了基因转录调控功能、肿瘤的发生和凋亡及错配修复等,进一步验证了微卫星不稳定状态可能通过影响上述基因的表达调控引发肿瘤的发生。
C:Microread MSI Panel与染色体的覆盖情况
        为了使这些微卫星位点能够更好地代表肿瘤的微卫星不稳定状态,在保证检测简洁、灵敏度、特异性好的基础上,这些位点在染色体上的分布如下图,我们尽可能覆盖不同的染色体。
 
 
六单核苷酸位点,更符合中国人群
        为了验证六位点MSI Panel的灵敏度与特异性,阅微基因进行了大量临床样本的验证。我们从微卫星的位移值检测的准确性和漏诊率等方面,对试剂盒的性能进行了分析和验证。
A:免疫组织化学的结果相比,总符合率为96.61%(95%CI:94.15%~98.24%),Microread MSI Panel具有很高的灵敏度和特异性。
 
 
        下图中可以直观的看到每个个体的位移情况,通过比较位移可以对不同的微卫星状态进行判断,说明通过毛细管电泳检测位移的方法,可以轻松实现对个体MSI状态的分析。
 
 
B:单核苷酸重复位点不同组合panel与MSI检测
        阅微基因参考A公司的体系构建了MR-Panel1(无NR-27),参考Bethesda推荐的pentaplex体系构建了MR-Panel2(无MONO-27),整合了A公司和pentaplex体系构建了MR-Panel3(6单核苷酸核心位点),比较3个不同panel的检测准确性和特异性。
 
 
        中国人群中,从单个位点来看,NR-24灵敏性较低,但特异性为100%。NR-27的灵敏性、特异性、准确性是6个位点中最佳的。3个panel的检测准确性都在95%以上,以MR-Panel3的灵敏性和准确性最高。当采用MR-Panel3时,检测的漏诊率为2.34%,相比于MR-Panel1和MR-Panel2分别降低了1.75%和2.34%。
 
 
C:六单核苷酸重复位点的Microread MSI Panel的中国人群验证结果
        658例临床结直肠癌样本及其对应癌旁组织,分别使用Microread MSI Panel和免疫组织化学方法进行对比检测,结果如下:
 
 
        综上所述,六单核酸位点组合Microread MSI Panel既符合国内外指南研究建议,又从大量的临床数据中选出MSI检测优势位点使其更符合中国人群,经验证新的位点组合MSI检测的性能也得到了优化,可以精准地对单核苷酸的微卫星状态进行判读。阅微基因微卫星不稳定状态检测试剂盒已经递交了国家第三类体外诊断试剂的注册申请。期待随着其在临床中更加广泛的应用,可以惠及大众。
        随着MSI技术的不断成熟,临床上也发掘出在其他癌种上的应用,下期小微妹会跟大家聊聊MSI检测在妇科肿瘤上的应用,敬请期待。
 
参考文献
[1]中国临床肿瘤学会结直肠癌专家委员会,中国抗癌协会大肠癌专业委员会遗传学组, 中国医师协会结直肠肿瘤专业委员会遗传专委会.《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》.
[2]Jafar N Nojadeh, et al. Evaluation of Microsatellite Instability in Tumor and Tumor Marginal Samples of Sporadic Colorectal Cancer Using Mononucleotide Markers. EXCLI Journal, 2018; 24(17): 945-951. 
[3]Gasper Berginc , Damjan Glavac. Rapid and Accurate Approach for Screening of Microsatellite Unstable Tumours Using Quasimonomorphic Mononucleotide Repeats and Denaturating High Performance Liquid Chromatography (DHPLC). Dis Markers. 2009;26(1):19-26.
[4]Buhard O, et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Dis Markers. 2004;20(4-5):251-7.
[5]De' Angelis GL, et al. Microsatellite instability in colorectal cancer. Acta Biomed. 2018;89(9-S):97-101.
[6]A Loukola, et al. Microsatellite Marker Analysis in Screening for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). Cancer Res. 2001;61(11):4545-9. 
[7]Asad Umar, et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. J Natl Cancer Inst. 2004;96(4):261-8. 
[8]Kathleen M Murphy, et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. J Mol Diagn.2006;8(3):305-11. 
[9]Jeffery W Bacher, et al. Development of a Fluorescent Multiplex Assay for Detection of MSI-High Tumors.2004;20(4-5):237-50. 

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