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中国人自己的 MSI 检测 | 凡是过往 皆为序章(上)

人阅读 发布时间:2020-07-31 14:05

    
01  寻根——微卫星到底是什么?
科学家们发现, 在人类基因组中分布着许多重复的 DNA 序列,这些序列大多位于基因与基因之间,因此它们在不同个体间的序列长度虽然不尽相同,但是不会影响个体间遗传功能的改变。这些高度重复的核苷酸序列 DNA 通常被称为卫星 DNA。

微卫星 (microsatellite,MS),也称为短串联重复序列(Short tandem repeat,STR),是人类基因组中少数几个核苷酸重复(通常是 1~6 个,或者更多)的现象。
STR 具有种属特异、遗传稳定的特点,使其在人类基因组遗传图谱的制作、癌症诊断、亲缘关系分析、法医学个体识别等领域都得到了广泛的应用。

 

02  必然——MSI与错配修复     
MMR 基因突变或者基因修饰(如甲基化),导致 MMR 蛋白功能缺失,当机体中的错配修复功能发生缺陷时,由于微卫星多次重复的特点更倾向出现复制错误,导致微卫星的缺失或插入,从而发生了微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)。

这种不稳定的状态连同 MMR 基因的缺失导致细胞内突变累积加速,进而引起致癌或抑癌基因表达调控变化,发生癌变。
 
 
        微卫星不稳定状态可以用来进行肿瘤辅助诊断。
        在结直肠癌的分子分型中,微卫星不稳定状态是一种重要的分型工具,帮助临床医生就疾病提出诊断和治疗方案。
 
来源:World J Gastrointest Oncol. 2013 Feb 15; 5(2): 12–19.

在《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》中,推荐对所有结直肠癌患者进行 MMR 蛋白/ MSI 检测,以明确患者是否属于林奇综合征。

林奇综合征是一种常染色体显性遗传疾病,由于错配修复基因的遗传性变异导致。90% 以上的林奇综合征患者发生了微卫星不稳定的情况。目前的林奇综合征的筛查面临着漏诊的问题,除了扩大对林奇综合征筛查的肿瘤谱之外,提高试剂的灵敏性,降低漏诊率也是临床急需解决的问题。
 
03  疑问——如何选择微卫星检测位点?      
  •  
MSI 确定除直接检测 MSI 外还可以通过 MMR 基因突变(或表观遗传学修饰分析)、二代测序方法以及 MMR 免疫组化检测实现。其中免疫组化检测最为简便,并且可以提供基因异常的线索。但免疫组化的判读需要检验医生具有比较丰富的阅片经验和病例积累,二代测序从成本和周期上暂时不具有优势。

用毛细管电泳的方法检测微卫星不稳定位点,面临的首要问题是「测哪个/哪些微卫星位点呢?」

为此,从 1993 年 Aaltonen 等人首次在家族性遗传性结直肠癌(HNPCC)中发现高频率的 MSI 现象(约 90% 的 Lynch 综合征患者存在 MSI-H 现象)开始,人们就开始寻找灵敏度高、特异性好的检测靶标。

选择合适的微卫星位点是 MSI 检测准确性的重要因素之一。结合文献研究和行业研究,汇总 MSI 检测的影响因素如下:
  • 微卫星类型(单-,双-,三-核苷酸):单核苷酸的微卫星具有更高的灵敏性,有研究表明随着微卫星核苷酸数量的增加,灵敏性呈逐渐下降的趋势;
  • 微卫星位点数量:并不是数量越多越好,增加微卫星可能会降低检测的灵敏性;
  • 微卫星在肿瘤中的不稳定检出率:阳性率越高的微卫星趋于有更高的灵敏性;
  • 微卫星位点的多态性:更倾向于单态的微卫星,可以降低结果判读的复杂性,增加判读的准确性;
  • 检测体系的兼容性:待检测的微卫星是否可以做到单管扩增,以实现操作简便、减少误差的目的。

 

04  历史——站在巨人们的肩膀上        
早在 1997 年,在美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)提出了 5 个微卫星的评价系统,包括:BAT-25,BAT-26,D5S346,D2S123,D17S250, 其中 D5S346, D2S123, D17S250 为双核苷酸微卫星。

2002 年,Suraweera 等的研究发现双核苷酸位点在 MSI-H 的检出率只能到 60%~80%,而且双位点核苷酸本身更趋于不稳定,对结果图谱判读的难度增大,容易得到错误的分类结果。他们研究出的 pentaplex 体系,含有 5 个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24), 检测灵敏性均在 95% 以上。在该团队后续的研究中,NR-22 由于扩增兼容性问题被 NR-27 替代。

2004 年 Bethesda 指南中指出了 pentaplex 体系的高灵敏性和特异性,同时指南中还提出可以选择一些多核苷酸位点作为内对照防止样品间的混淆。

2006 年,国外某厂家(以下简称「A 公司」)的 7 位点 MSI 检测体系出现,包括 5 个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,MONO-27,NR-22,NR-24)和 2 个对照位点(PentaC,PentaD)。该体系中使用 MONO-27 替代了 NR-22。至此,基于 PCR 法中的 5~7 个标志位点组合被认定为 PCR-MSI 检测的金标准。
 
 
        结合前辈们的研究数据和行业指南,我们最终选择了一个 6 种单核苷酸重复的组合,如下:
 
 
        这些位点涵盖了几乎所有的经典可靠的微卫星位点,如下图:
 

为什么单核苷酸重复位点具有更高的灵敏度和特异性呢?
为此我们也进行了一些探究,可能的原因如下:

A:单核苷酸重复位点更倾向单态
单核苷酸微卫星通常存在于一些基因的非翻译区或 5』UTR 或 3』UTR 区域,由于一些不明确的原因,有些单核苷酸的微卫星是更倾向于单态的。研究表明 BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24 位点在高加索人中的多态性均不到 1%,是接近单态的位点。
阅微基因前期在 327 个中国人群中的研究发现,以下 6 个位点的杂合度在 1%~10% 之间。

 

 

    
B:选择的 Microread MSI Panel 与基因转录调控功能相关
同时,这些位点所在的基因参与了基因转录调控功能、肿瘤的发生和凋亡及错配修复等,进一步验证了微卫星不稳定状态可能通过影响上述基因的表达调控引发肿瘤的发生。

C:Microread MSI Panel 与染色体的覆盖情况
为了使这些微卫星位点能够更好的代表肿瘤的微卫星不稳定状态,在保证检测简洁、灵敏度、特异性好的基础上,这些位点在染色体上的分布如下图,我们尽可能覆盖不同的染色体。
 


 
 

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